qPCR检测方法及产物检测注意事项

qPCR检测方法

qPCR的目的是在PCR期间监测目标DNA分子(DNA或cDNA)的扩增，PCR产物的实时检测可以通过使用DNA结合染料和荧光PCR引物或探针两种方法来实现。

DNA结合染料是一种非特异性的荧光染料，与任何双链DNA分子(dsDNA)相互作用。这些染料的化学性质可能很简单，但它们非常有效。DNA与染料结合所释放的荧光量与dsDNA的数量成正比，常用的DNA结合染料的例子是SYBR Green。

与DNA结合染料不同的是，荧光PCR引物和基于探针的化学反应可以根据荧光淬灭的原理对目标DNA序列进行特异性结合。在本质上，PCR引物或目标特异性寡核苷酸探针被标记报告基团，并被淬灭基团淬灭。一旦引物或探针与特定的目标序列结合，报告集团和淬灭集团被一个特定化学的机制分开(裂开或因距离分开)，产生荧光。所释放的荧光量与样品中特定的目标DNA数量成正比。

qPCR产物检测考虑事项:

1、特异性

DNA结合染料的优点之一是它们理论上可以与任何一种dsDNA分子进行插入，提供一个强大的信号读出。然而，由于这种非特异性，如果你的PCR扩增出了错误的目标，或者超过一个目标，或者形成引物二聚体分子，DNA结合染料会结合并报告这些dsDNA分子。这会给你一个假阳性信号。可以通过在qPCR实验后进行熔融曲线或离解曲线来监测。一般来说，如果不太关注目标的特异性，并且试图表现出许多基因的快速表达，或者正在检查你的PCR引物的特异性，那么DNA结合染料是一个理想的选择。 

相比之下，荧光PCR引物和基于探针的化学反应是高度特异性的，这使得输出数据更加方便。如果想要真正放大你的目标序列，它们是理想的。对于在很长一段时间都集中在同一组基因的研究人员，这往往是一个很受欢迎的选择。

2、成本

在计划任何实验时，成本都应该考虑在内。DNA结合染料只需要购买引物(很像传统的PCR)，相对便宜。荧光化学实验所需要的特异性探针和引物使这些方法昂贵得多,不过，如果你只有几个目标，那可能是较好的选择。

3、目标的丰度

当你的目标是很少或弱表达时，引物通常会形成二聚体结合到到错误的目标。在这种情况下，你应该使用基于荧光的化学反应。如果你的兴趣目标更丰富，可以研究使用DNA结合染料的可能性。

qPCR探针的选择

当涉及到荧光PCR引物和基于探针的化学反应时，有很多选择。这取决于你可以使用哪种PCR仪器。不同的探针会以不同的波长发出荧光，并不是所有的仪器都会探测到所有的探针。

1 .成本

考虑降低成本的情况，水解探针和蝎子探针是很好的选择。与目前市面上所有的荧光化学物质相比，水解探针是目前市场上不仅可靠，而且更便宜的一种，如TaqMan。由于引物的茎环结构，蝎子系统不需要开发和购买单独的探头，使它们成为一个方便且具成本效益的选择。

2．时间

考虑时间的情况，蝎子探针可能是一个解决方案。不仅引物和探针存在于一个茎环分子上，而且可以在快速循环条件下工作。水解探针也可能是理想的，因为它们非常可靠的，故障排除小。这些往往被广泛用于高通量扩增分析。

3 .特异性:

如果你的目标很少，这将是一个非常重要的问题，可以考虑分子信标探针和双杂交探针。当结合到目标时，由一个分子信标探针发射的荧光量通常比在自由溶液中释放的光量大100倍。双杂交的化学性质是有两个探针，促进更高的特异性。